鐵嶺北川園林

現(xiàn)代生物技術(shù)特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)有效縮短了育種時間，克服了一些農(nóng)藝學(xué)的問題和環(huán)境問題，這些問題通過傳統(tǒng)的方法無法解決。利用生物技術(shù)的方法，如通過組織培養(yǎng)擴大月季繁殖，通過體細胞無性系的變異及遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，豐富月季的染色體組，本文就這方面的問題進行了綜述。 一、引言 植物組織培養(yǎng)技術(shù)在園藝上的較好個有效利用是1920年在實驗室條件下誘導(dǎo)蘭花種子萌發(fā)。植物組織培養(yǎng)在栽培植物的大面積商業(yè)應(yīng)用出現(xiàn)在30年前。與草本植物相比，木本植物僅有150多個應(yīng)用比較廣泛的種類被成功擴繁。月季作為商業(yè)切花作物之一，常常通過芽接的方法進行繁殖。月季的育種目標(biāo)是提高各項生物學(xué)特性以增強其觀賞價值，包括花的顏色、大小、形狀、開花持續(xù)時間及對環(huán)境的適合性。盡管理想的特性被經(jīng)典育種所采用，但仍有一些因素限制了這一方法。 首先是基因庫的限制；第二是不親和性染色體倍性的差異限制了遠緣雜交；第三，某些特性如生長的均勻性和開花是受多基因控制的。各種因素巧妙的平衡決定了植物的生長和發(fā)育。這種平衡將被有性雜交和篩選所改變。可以設(shè)法用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法和其它生物技術(shù)方法來建立轉(zhuǎn)化體系。細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展為開發(fā)新的種質(zhì)資源提供了機會，這種種質(zhì)資源可以滿足變異的需要。 月季基因工程戰(zhàn)略是有價值的，因為它促進了單個基因的改變而不會破壞原有的特性所表現(xiàn)的商業(yè)價值。轉(zhuǎn)基因在月季方面的應(yīng)用有很大的潛力�？梢蕴岣呖共∠x能力，改善花色、形態(tài)結(jié)構(gòu)和瓶插壽命。月季野生種和栽培種的鑒定可以通過各種分子標(biāo)記（RLFP和RAPD）和同工酶技術(shù)進行。月季擴繁方面的廣泛研究使我們對擴繁有了一個全新的認識，近年來生物技術(shù)的應(yīng)用給月季研究的各方面提供了有利條件。 二、月季育種薔薇屬是一個非常大的家族，確切的種類和數(shù)目目前還不清楚，我們現(xiàn)在的月季已經(jīng)經(jīng)過了幾個世紀的人工雜交和自然變異的歷史過程。大部分栽培月季分布在北半球的溫帶，亞洲是其基因中心，大多數(shù)的種在亞洲被發(fā)現(xiàn)。月季的染色體數(shù)目從2n=2X=14到2 n=8X=56，大多數(shù)是二倍體或是四倍體，商業(yè)性種植的栽培通常是三倍體或四倍體。育種家對月季突變表現(xiàn)出很大的興趣，頻繁發(fā)生的自然突變加大了遺傳物質(zhì)的變化。 Jacobs等1970年報告了離體技術(shù)在突變體的繁殖方面的應(yīng)用。從 1937年到1976年，發(fā)現(xiàn)865種月季是通過自然突變產(chǎn)生的，289種具有攀緣性。月季類別不同突變頻率也不同。因此，研究突變基因的遺傳很有意義。已經(jīng)發(fā)表的月季突變育種方面的文章很多，James（1983 ）報告了兩個誘導(dǎo)突變體，波拉（Paula）來自栽培品種伊麗莎白皇后（Queen Elizabeth），粉紅帽子（Pink Hat）來自不知名的薔薇。它們是通過γ射線照射正在生長的頂芽而獲得的。Ｂｅｎｅｔｋａ于１９８５年分別用０、２０、３０、４０和６０ＧＹγ射線照射切下的單芽，觀察了４代，他發(fā)現(xiàn)４０－５０ＧＹ是較佳處理。Ｗａｌｔｈｅｒ和Ｓａｕｅｒ（１９８６）用離體技術(shù)，通過用Ｘ射線處理來增加植物的變異性。 三、無菌培養(yǎng)的建立 對離體培養(yǎng)來說，弄清植物的生理狀態(tài)及對不同病原菌的敏感性是非常必要的。通常大多數(shù)外植體要用5-10%的去垢劑溶液洗20分鐘，也可用0.1%HgCl2 殺菌20-25分鐘，接著用蒸餾水沖洗2-5次，再轉(zhuǎn)到M S（Murashige and Skoog 1962）培養(yǎng)基上或木本植物培養(yǎng)基（Loyd and Macown 1981）或B5培養(yǎng)基（Gamgorg et al 1968），再補充不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑。較初的外植體必須先用20%的酒精處理20-30 秒，接著用0.1%HgCl2處理，然后用無菌蒸餾水沖洗。在某些情況下，剛開始培養(yǎng)幾個月后，從外植體切口末端會分泌出乳白色的內(nèi)部污染物。 四、防止培養(yǎng)基氧化當(dāng)外植體在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，會出現(xiàn)兩個主要問題，其中之一是褐變，它被認為是從外植體切口處流出的多酚氧化酶被氧化的結(jié)果，褐變可以通過加入諸如PVP（聚乙稀吡咯）、檸檬酸或抗壞血酸阻止氧化而克服，也可以接種后在黑暗中培養(yǎng)1-2天，因為人們發(fā)現(xiàn)光能影響多酚氧化酶的活性。在大多數(shù)情況下，每6-7天要把外植體轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上，通過反復(fù)的再培養(yǎng)，褐變問題就能解決。 五、增殖方法 Mar和Zieslin（1987）論述了生長調(diào)節(jié)劑在月季增殖方面的作用，每一個頂端或葉腋的分生組織都有發(fā)育成具有自然分枝系統(tǒng)的主枝的能力，并且具有無限增殖的潛能。不定芽是特定的愈傷組織細胞發(fā)育產(chǎn)生的。愈傷組織是修剪或受傷引起的傷害反應(yīng)。 １．分生組織培養(yǎng) 2.愈傷組織培養(yǎng)和植株再生 3.花藥培養(yǎng) 4.原生質(zhì)體培養(yǎng) 5.花粉培養(yǎng) 6.懸浮培養(yǎng) 六、根的發(fā)育 在離體下，由正常生長的幼芽成功進行根的誘導(dǎo)，究竟是直接在綜合培養(yǎng)基上進行，還是在去掉CTK的培養(yǎng)基上進行，取決于種和品種，生根能力還取決于內(nèi)部物質(zhì)的互相作用及外部因素。Skirvin和Chu(1 979)在不加生長調(diào)節(jié)劑的固體培養(yǎng)基上用月季的再生幼芽誘導(dǎo)生根。許多學(xué)者報告在外加低濃度生長素（IAA或IBA或NAA）0.1-0.5毫克/升范圍內(nèi)，并降低蔗糖濃度可以很容易地從切下的成熟幼芽上誘導(dǎo)生根。 Savies（1980）在幾個栽培品種的月季上用外加40g/L蔗糖，不加生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上生根，成熟率達100%，Khosh-Khui和Sink（19 82）報告了不同濃度的生長素混合物，在不同溫度和光照下對月季婚禮粉生根的影響，他們認為，IAA（0.0-0.1毫克/升）和NAA(0.0-0.1 毫克/升)對誘導(dǎo)生根是有效的，不同濃度的鹽、生長素、庶糖、瓊脂及pH值和不同光周期對月季根發(fā)育的影響已經(jīng)有了大量的研究，但培養(yǎng)環(huán)境如溫度和光照對生根影響方面的報告很少。 Khosh-Khai和Sink(1982b.c)在大約1.0klax光照度下使80%的婚禮粉成功生根，他們觀察到高光照度(3.0klax)會抑制生根，另一方面，他們注意到培養(yǎng)箱中，不論光照度為多少，培養(yǎng)瓶陰涼的低位部分微小幼芽的生根較好。Bresson等（1982）報告每天12-24小時17mmol / m2.s的光通量密度對開始生根是較適宜的。 Skirvin和chu（1984）和Skirvin等（1984）發(fā)現(xiàn)紅光對微型月季的生根有利，他們還用離體的雜種月季增輝（Improved Blaze）已經(jīng)發(fā)育的幼芽，通過降低MS培養(yǎng)基的鹽濃度（6.0-7.5毫米）成功誘導(dǎo)生根。把幼芽末端在1毫米IAA的溶液中浸幾個小時，以代替含有生長素的培養(yǎng)基，也能成功誘導(dǎo)生根。 Khosh-Khui和Sink（1982）報告1/2MS培養(yǎng)基外加NAA（0.54微摩爾/升）可以使雜種月季新娘的面紗（Brida Veil）誘導(dǎo)生根。Sauer 等（1985）報告10個不同品種的月季在1/3濃度的MS培養(yǎng)基上外加5.7 微摩爾/升的IAA，在10-14天內(nèi)生根。隨后，Douglas等（1989）用伊麗莎白皇后幼芽（大于2mm）在稀釋到1/4濃度的MS培養(yǎng)基上，在沒有生長調(diào)節(jié)劑的情況下成功獲得了非常高的生根率。 Rout等（1990）報告了7個不同的月季品種在1/2MS培養(yǎng)基上外加 0.1-0.25毫克/升NAA或2，4-D或二者混合物，8-10天內(nèi)的生根情況，涉及的雜種月季品種有蘭道爾（Landorn）、伊麗莎白皇后，處女座（ Virgo），超級巨星（Super star）、海珍珠（Sea pearl）、幸福（Happiness），其生根率分別為90.9%、87.5%、92.0%、99.2%、86.2 %和83.9%。經(jīng)過8-10天的培養(yǎng)，微小幼芽的生根在固體培養(yǎng)基中比在液體培養(yǎng)基中好，生根與微小幼芽的芽齡和大小有關(guān)。Rount比較了3 個處理對6個雜種月季品種的生根反應(yīng)，幼芽長度和芽齡分別為0.5-1 .0厘米4周、1.5-2.0厘米6周、2.0-2.5厘米8周。生根率較高的（92 -98%）是6周齡1.5-2.0厘米長的幼芽，放在IBA（1.0毫克/升）的溶液中浸15-20分鐘后在無菌營養(yǎng)基上培養(yǎng)。Amold等（1995）報告用朝鮮月季約翰富蘭克林(John Franklin)和冠軍（Champlain）的幼芽在低濃度或缺少生長素及高鹽濃度的培養(yǎng)基上生根良好，冠軍生根較適宜的條件是在高IAA濃度下，降低鹽濃度和IBA及NAA濃度。月季和平的離體幼芽在外加0.5毫克/升IBA的1/2MS的培養(yǎng)基上生根良好。 七、體細胞的胚體形成在離體增殖的方法中，通過體細胞的胚體形成給無性系的增殖提供了巨大潛力，因為單個的細胞能誘導(dǎo)產(chǎn)生一個胚體較后形成完整植株。許多研究人員用月季的葉子、節(jié)間、雄蕊的花絲、根和受精的胚使體細胞的胚體形成獲得成功。Wit等用栽培品種多米格（Domingo）、備用鑰匙（Vic key）、褐色（Brown）的葉作外植體，在1/2MS培養(yǎng)基上外加0.1×10-6激動素和0.05×10-6NAA培養(yǎng)了6-12周，觀察體細胞體。Rount等（1991）報告胚體發(fā)生的誘導(dǎo)及其后來的發(fā)育，愈傷組織用栽培月季品種南道爾末成熟的葉和莖段產(chǎn)生的愈傷組織，用1/2MS培養(yǎng)基外加2.2微摩爾/升BA，0.05微摩爾/ 升NAA，0.3微摩爾/升GA3和200-800毫克 / 升的脯氨酸。玫瑰（Rosa Rugosa）未成熟的種子在沒有生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)胚體的形成。DAS等（1993）觀察到體細胞胚體形成的誘導(dǎo)依靠碳水化合物的類型和組成。體細胞胚體的較大產(chǎn)量在含有0.1摩爾/升果糖或蔗糖而缺乏生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上獲得。Moyne等(1993)建立了與再生潛力有關(guān)的雜種月季胚體形成的細胞體系，他們還報告了在愈傷組織中，大多數(shù)細胞是4倍體。Das等（1993）觀察到在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入麥芽糖（20克 / 升）能提高正常胚體的產(chǎn)量。Salm等（1996）報告了月季黃金大道（Money Way）體細胞胚體的形成和幼芽再生，培養(yǎng)基用的是無激素的SH（Schenk and Hildebrand 1972）培養(yǎng)基外加500毫克/ 升水解態(tài)的酪蛋白、87毫克/升蔗糖、1000毫克/升肌醇、100毫克/升脯氨酸、5毫克/升煙酸、0.5毫克/升吡哆鹽酸，5毫克/升硫胺鹽酸。 在加有2.2微摩爾/升BA，0.05微摩爾/升NAA，0.05微摩爾/升GA3 的培養(yǎng)基每4周一個間隔對胚體形成的愈傷組織團進行再培養(yǎng)，能誘導(dǎo)出體細胞胚體次生物，且能長期保持（16個月），在培養(yǎng)基中加入2， 4-D有助于愈傷組織長期保存。Kunitake等注意到受精的胚有能力使體細胞胚體在沒有外源生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上正常發(fā)育，但這個胚體形成在6個月以后不再持續(xù)。Rout等在蘭道爾的愈傷組織培養(yǎng)中報告了體細胞胚體形成和再生的發(fā)育順序。 胚的發(fā)育和體細胞胚體的萌芽是形成植株的前提。關(guān)于月季栽培品種有許多報告表明，省略或降低培養(yǎng)基中2，4-D的濃度有利于胚的發(fā)育和萌芽。Mathews等（1991）報告在雜種月季中有30%的體細胞胚體在轉(zhuǎn)到無激素的SH培養(yǎng)基上后，能萌芽形成新的植株。Noriega和S ondahl（1991）及Roberts等（1990）報告在培養(yǎng)基中加入ABA和GA3 有助于胚的發(fā)育。Rount等（1991）報告在初培養(yǎng)時加入脯氨酸，利用它在再生培養(yǎng)基中的排斥作用，可刺激胚發(fā)育，降低發(fā)育異常的頻率。他們還報告在1/2MS培養(yǎng)基上外加0.5毫克/升BA，0.1摩爾/升GA3和1. 5毫克/升硫酸腺嘌呤，在8℃下培養(yǎng)4天能使萌芽率從0提高到12%。Ro berts等（1995）報告在4℃以下培養(yǎng)2周，能使萌芽率從12%提高到24 %。Kunitake等（1993）報告在含有0.1摩爾/升山梨糖醇而沒有生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，用玫瑰的體細胞胚芽形成了新的植株。 八、煉苗和大田移栽 九、離體培養(yǎng)中無性系的穩(wěn)定性 十、遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化 十一、結(jié)論 本文總結(jié)了月季生物技術(shù)方面的研究進展。影響月季擴繁的因素很多，無論直接用沒有形成愈傷組織的外植體還是間接地用有生長潛能的外植體，都能使不同種或品種的月季離體的不定幼芽再生。體細胞胚體的形成給體細胞雜交、冷凍保存和基因轉(zhuǎn)化的研究提供了條件。植物細胞基因控制方面的較新進展為月季的研究打開了新的思路。把外源基因轉(zhuǎn)移到植物體中主要依靠離體再生系統(tǒng)的再生效率�；蜣D(zhuǎn)化可以通過許多方法實現(xiàn)，包括通過顯微注射把DNA直接插進原生質(zhì)體。但較重要的突破是基因槍的出現(xiàn)�；驑屖峭ㄟ^表面涂有DNA的鎢或金的微粒轟擊再生組織。在轉(zhuǎn)基因月季發(fā)育的早期可以用DAN隨機擴增多態(tài)性（RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、限制酶片段長度多態(tài)性（RFLP）等分子標(biāo)記的方法進行檢測，以觀測遺傳物質(zhì)的變化。研究人員Marchant等（1998a）用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)使轉(zhuǎn)基因月季的再生獲得成功。Marchant等（1998b）報告幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)基因在控制月季黑斑病方面的表達，他們表示抗病基因轉(zhuǎn)入月季能提高觀賞植物的價值。 離體培養(yǎng)技術(shù)和其他生物技術(shù)在提高月季抗病蟲性、花色、形態(tài)和瓶插壽命方面有重要作用。單倍體離體培養(yǎng)將有助于產(chǎn)生純合體，胚培養(yǎng)有助于多種月季的雜交，提高產(chǎn)量和繁殖系數(shù)。這些技術(shù)有助于我們認識月季基本的遺傳物質(zhì)。另外，把月季作用木本植物生物技術(shù)的模式物種，在研究染色體倍性方面有重要作用，因為月季核DNA數(shù)量少，完成開花的周期短，種子產(chǎn)量較高，有大量的可供利用的栽培品種。